Устранение нейроповреждений сверхкороткими лазерными импульсами

Повреждения нейронов (нейроповреждения) приводят к необратимым изменениям в клетках, органах и функциях организма. Они происходят вследствие:

• травм,
• инфекционных и воспалительных процессов,
• интоксикации,
• наследственных заболеваний,
• неспецифических патологий (гипогликемии, анемии, снижения мозгового кровообращения, рассеянного склероза и др.).

Канадские ученые недавно разработали новый универсальный метод восстановления связей между нейронами с применением лазера, излучающего фемтосекундные (предельно короткие) лазерные импульсы. Универсальность метода в том, что его можно применить для любого типа клеток, в том числе и тех, посредством которых передается информация.

Нейроны: как осуществляется межклеточная коммуникация

Передача информации в нервной системе происходит посредством электрического импульса и химического сигнала: этот тип связи осуществляется в синапсе — межфазовой контактной площадке двух нейронов.

Работа и ЦНС (центральной нервной системы), и ПНС (периферической нервной системы) происходит аналогично. Это возможно, благодаря нейронам и синаптической сети — средствам межклеточной коммуникации.

Строение нейрона

Типичный нейрон состоит из тела клетки (сомы), дендритов и аксонов:

• Дендриты — это короткие и разветвленные отростки нейронов.
• Аксон — это клеточное расширение, проходящее большие расстояния в теле человека и других биологических видов. Аксон может сделать несколько переходов и по окончанию подсоединиться к нескольким клеткам.

В головном мозге взрослого человека существует около 300 триллионов синапсов.

Передача нейронных связей

Связи между нервными клетками осуществляются такими способами:

• от аксона одного нейрона к дендритам или сотовому телу другого;
• от аксона к аксону;
• от дендритов к дендритам и т. д.

Клеточные мембраны сомы и аксона активируют напряжение в электропроводящих закрытых ионных каналах (Ca, Na, K и хлорид-ионных).

Почему необратимы повреждения нейронов

Нейрон — специфическая клетка, не способная делиться, особенно в зрелом возрасте. Поэтому повреждение нерва из-за травмы может привести к нарушению функций периферической нервной системы.

Паралич после травм спинного и головного мозга, потеря чувствительности связаны с полным блоком проводимости -обрывом связей между эфферентными (двигательными) и афферентными (чувствительными) нейронами.

(Но утверждение о том, что нейрогенез у взрослого человека вообще не происходит, ошибочно. Да, нейрогенез зависит от многих внешних условий, и может угнетаться от вредных воздействий (радиации, химических веществ, стрессы), но появление новых нейронов происходит и у взрослых, особенно в гиппокампе, в височных отделах головного мозга.

Подробнее о регуляции нейрогенеза, о способах воздействия на него — в интересном видео в конце статьи).

Типы повреждения нейронов

• Валлерова дегенерация:
  • Разрыв нерва, повреждение аксона и его миелиновой оболочки.
  • Через неделю после травмы начинается блокировка проводимости.
  • Восстановление возможно, если сохранена базальная мембрана (в ее функции входят производство миелина (Шванн клеток) и выбор (аппроксимация) нервных окончаний).
  • Результатом такого повреждения может стать мышечная атрофия в зоне иннервации нейрона.
• Сегментная демиелинизация:
  • Повреждение ограничивается миелиновой оболочкой.
  • При сохранении аксона мышечная дистрофия не наблюдается.
• Дегенерация аксонов:
  • Повреждается тело нервной клетки, и происходит дистальная гибель аксона.
  • Развитие мышечной атрофии происходит при отсутствии повторной иннервации от соседних нервов.
  • При таком типе повреждения возможно лишь частичное восстановление.

Экспериментальные методы восстановления повреждения нейронов

Последнее десятилетие ученые бьются над новыми методами, позволяющими не допустить блокировку проводимости и смерть аксонов после травмы и сохранить жизнеспособность нейронной сети:

• Разрывы аксонов устранялись путем помещения поперек разрыва разрешительной матрицы.
• Проводилась клеточная терапия ноотропными препаратами для стимуляции роста и регенерации поврежденных аксонов.
• В качестве альтернативных методов при повреждениях миелиновой оболочки применяли ингибиторы роста ассоциативных нейронов и ингибиторы роста рубца.
• Для предотвращения гибели клеток после травмы использовалась молекулярная защита.

Однако все эти обнадеживающие методы имели лишь частичный успех.

Пока не удается сделать главное:

Избирательно подсоединить конкретный аксон к телу клетки нейрона.

Когда удастся произвести соединение отдельных нейронов, в науке произойдет настоящий переворот и откроются двери для беспрецедентного исследования в области неврологии, физиологии, клеточной биологии и биохимии. Возможно будет лечить тяжелые травмы спинного мозга и периферические поражения нервной системы.

Лазерный метод соединения разрыва нейронов

Цели:

• Восстановить связи между нейронами сразу после травмы и предотвратить блокировку проводимости.
• Проверить гипотезу о физической привязанности и восстановлении при приближении нервных окончаний.

Лазерная технология с применением фемтосекундных импульсов — яркий кандидат для избирательного подсоединения нейронов. Она используется в нанохирургии как метод лечения рака:

• для ортопорации (открытии переходного канала в клеточной мембране)
• трансфекции (внедрении нуклеиновых кислот в ядерные клетки).

Удалить или ионизировать можно материал размером менее дифракционного пятна без ущерба для окружающих тканей.

Фемтосекундные лазерные импульсы были также использованы в качестве инструмента для изучения регенерации нейронов путем разделения нейронов и аксонов.

Но физическое соединение отдельных нейронов до сих пор не выполнялось.

Суть эксперимента

В результате испытания под воздействием лазерного излучения с точными параметрами настройки на культивированном в растворе DMEM биоматериале была произведена гемифузия (слияние) двух фосфолипидных мембран клеток нейронов.

Параметры лазерного излучения и биоматериал

Слияние достигнуто с помощью фемтосекундных лазерных импульсов с длиной волны 800нм, с параметрами излучения:

• интенсивность и разрешающая способность соответственно:
  • 1,7 (± 0,08) x 10 ¹² Вт / см 2 и ± 0,5 мкм;
• частота повторения 80Мгц;
• эффективный размер пятна — 600нм.
• идеальное время облучения составило один-два 15 мс импульсов (т.е. 1,2×10⁶ импульсов).

В качестве биоматериала использовались:

• P19 клетки тератокарциномы мыши;
• Neuro2A клетки нейробластомы мыши;
• телячья, бычья и коровья сыворотка.

На рис. 1 представлены суть эксперимента:

1. Фемтосекундный лазерный импульс доставляется в целевую точку между аксоном и телом нервной клетки (сомой).
2. Фосфолипидные бислои нейрона сомы и аксона до воздействия лазера (кругом отмечена область прикрепления фософолипидных слоев).
3. Лазерный импульс высокой интенсивности вызывает обратимую дестабилизацию обеих фосфолипидных слоев. Под воздействием фемтосекундного лазерного импульса в индуцированной зоне слияния аксон-сома сгенерированные свободные ионы (показаны красным цветом) и свободные электроны (показаны оранжевым) пересекают неполярную центральную область и разрывают связи между жирными кислотами гидрофобных хвостов.
4. В результате процесса релаксации в целевой точке формируются новые стабильные связи и особая гемифузионная клеточная мембрана — общий фосфолипидный бислой.

Как проводилось лазерное соединение нейронов

• Выбирались и выделялись клетки для соединения и приводились в контакт с использованием оптического пинцета таким образом, чтобы выступающий аксон одного нейрона коснулся сомы другого нейрона.
• Клетки оставлялись на какое-то время, чтобы убедиться, что между ними не происходит естественного слияния, после чего они растаскивались оптическим пинцетом.
• Затем нейроны опять сближали и при помощи фемтосекундных лазерных импульсов облучали область между аксоном и сомой клетки.
• Для подтверждения соединения один из нейронов перемещался пинцетом внутрь подвески чашки:
  • было обнаружено, что все остальные нейроны следовали за ним, скручивались и поворачивались как одно целое.

Рис. 2 демонстрирует последовательность соединения одного нейрона к нескольким и создание цепочки нейронов с использованием фемтосекундных лазерных импульсов (стрелками обозначена связь аксона и сомы).

1. Присоединение двух Neuro2A клеток, где аксон клеток (I) прилагается к соме (II).
2. Второй аксон Neuro2A (I) соединяется с сомой Neuro2A (III).
3. Демонстрируется неразрывность новых связей при повороте соединенных клеток на 30° относительно прежнего положения.
4. Определены и выделены две группы четырех P19 клеток.
5. Аксон нейрона (I) вступил в контакт и был связан с сомой (II) с помощью фемтосекундных лазерных импульсов, и обе группы соединились.
6. Положение цепочки после того, как ее повернули оптическим пинцетом.

Таким образом были прикреплены несколько групп нейронов.

Заключение

На протяжении всего наблюдения и проведенных манипуляция нервные клетки показали свою жизнеспособность и прочность крепления.

Фемтосекундный лазер-индуцированной способ соединения нейронов потенциально может обеспечить научный прорыв, который откроет новые горизонты в исследованиях влияния соединительных нейронов прямо перед или после травмы. Сохранение жизнеспособности нейронной сети позволит исследователям изучать новые сложные патофизиологические процессы, такие как нейрогенез, валлеровская дегенерация, сегментарная демиелинизации и дегенерация аксонов. Это позволит дальнейшее развитие новых методов лечения нервных травм и болезней.

(По материалам статьи научного журнала Nature. Scientific reports)

Видео: Взрослый нейрогенез